PAM50的概念及分子分型算法原理

众所周知，癌症具有异质性，在乳腺癌领域，不同亚型的癌症比不同器官来源癌症的差异要大很多。最简单癌症分类，当然是一个基因，比如ER阳性或者ER阴性的乳腺癌患者，并不是说人类有2万多个蛋白编码基因就可以有2万多种分类，其实在乳腺癌领域常用的分类，就是ER,HER2,PR等等，如果这3个基因都不表达，就是临床里面比较恶性的三阴性乳腺癌啦。

如果你并不研究乳腺癌，你可能会思考，如果是根据3个基因的表达量高低，比如ER,HER2,PR，那么应该是2X2X2=8种分类，但是实际上通过IHC分型（就是检查具体基因表达量）方法，乳腺癌被划分为激素受体（ER、PR）阳性组和阴性组，然后各自划分2个组，也就是4个组：

• 激素受体（ER、PR）阳性组
• 管腔A型（ER阳性，PR≥20%，HER2阴性，Ki-67＜20%）
• 管腔B型（ER阳性，PR＜20%和/或HER2阳性和/或Ki-67≥20%）
• 激素受体（ER、PR）阴性组
• HER2过表达型（ER阴性，PR阴性，HER2阳性）
• 基底样型（ER阴性，PR阴性，HER2阴性）

可以看到，这些具体的检测指标是具有一定的可操作空间，灵活性，而且IHC检测的是蛋白表达水平，而我们通常是拿到的mRNA层次的表达矩阵，阳性和阴性这样的二元分类概念会量化成为了具体的表达量数值。而根据表达矩阵来进行癌症亚型的划分，就是分子分型(GEP)，比如基于PAM50的GEP分型可将乳腺癌分为不同的亚型，包括表达雌激素受体（ER）相关因子的亚型（管腔型）、表达人类表皮生长因子受体2（HER2）相关通路因子的亚型（HER2过表达亚型）和表达基底因子但不表达激素受体通路的基底样乳腺癌（BLBC）亚型。

考虑到乳腺癌领域应用最广泛的就是基于PAM50的GEP分型，有必要系统性学习一下它的分型原理。

50个基因的来龙去脉

Parker et al (2009) published microarray data (GEO data set GSE10886)，数据可以比较方便的下载，重现整个分析思路也不难，简单理解一下：

• 4个基因表达芯片数据集，定义了“intrinsic” gene set ，有1906个基因
• 对189病人的1906个基因的表达矩阵层次聚类（median centered by feature/gene, Pearson correlation, average linkage）
• 使用SigClust对层次聚类结果划分cluster
• SigClust得到9个cluster，包含 luminal A (dark blue), luminal B (light blue), HER2-enriched (pink), normal-like (green), and basal-like (red).
• 然后精简基因集，每个分组选择top10的基因，得到5个分组的共50个基因。这里使用了Classification by Nearest Centroids (ClaNC) 算法。
• 也就是说189个病人里面的122个划分结果与qRT-PCR 一致。

如下所示：

SigClust得到9个cluster

因为有了PAM50，所以以后临床实践只需要测定50个基因的表达量即可对病人进行初步分类。而且作者提供了全套代码和数据：

• The centroids, gene lists, and R code to produce the classification are all available along with the clinical information for the training set on this page: https://genome.unc.edu/pubsup/breastGEO/
• Specifically, the R code and supporting data files are here: https://genome.unc.edu/pubsup/breastGEO/PAM50.zip
• And the centroids alone are here: https://genome.unc.edu/pubsup/breastGEO/pam50_centroids.txt

那么如何使用这50个基因的分类器呢？

PAM50分子分型

step1：拿到50个基因在所有样本的表达量矩阵

比如作者给出的例子是："220arrays_nonUBCcommon+12normal_50g.txt"文件，很明显，有233个样本啦！

trainFile='220arrays_nonUBCcommon+12normal_50g.txt'
phe=t(read.table(trainFile,sep = '\t',row.names = 1)[1:2,])
head(phe)
x<-read.table(trainFile,skip = 2,sep = '\t',row.names = 1)
x[1:4,1:4]
colnames(x)=phe[,1]
dim(x)
# 因为是 "220arrays_nonUBCcommon+12normal_50g.txt"， 所以是232个样本：
boxplot(x[,1:4])
standardize<-function(x){
  annAll<-dimnames(x)
  x<-scale(x)
  dimnames(x)<-annAll
  return(x)
}
x<-standardize(x)
x[1:4,1:4]
boxplot(x[,1:4])
# 表达矩阵被zscore后，数据量集中在0附近

step2：读取分类器

trainCentroids='pam50_centroids.txt'
# load the published centroids for classifcation
pamout.centroids<-read.table(trainCentroids,sep="\t",header=T,row.names=1)
head(pamout.centroids)
# pam50的5个亚型的50个基因的
boxplot(pamout.centroids)
pheatmap::pheatmap(pamout.centroids)
rowSums(pamout.centroids)

step3: 把表达矩阵和分类器进行比较

这个时候有3种比较的算法，就是euclidean距离，以及pearson或者spearman相关系数！载入前面处理好的分离器和表达矩阵，然后简单比较即可：

rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(ctc) 
load(file = 'input_for_pam50.Rdata')  
overlapSets<-function(x,y){

  # subset the two lists to have a commonly ordered gene list
  x<-x[dimnames(x)[[1]] %in% dimnames(y)[[1]],]
  y<-y[dimnames(y)[[1]] %in% dimnames(x)[[1]],]

  #and sort such that thing are in the correct order
  x<-x[sort.list(row.names(x)),]
  y<-y[sort.list(row.names(y)),]

  return(list(x=x,y=y))
}
temp <- overlapSets(pamout.centroids,x)
# 如果表达矩阵和分类器共有基因少于50个，要注意一下。
centroids <- temp$x
tmp <-  temp$y
library("impute")
dat=t(as.data.frame(impute.knn(as.matrix(t(temp$y)))$data))
# 200个样本的表达矩阵，去PAM50矩阵进行对比计算  

d1=apply(centroids,2,function(i){
  # dist 函数返回倒三角矩阵
  dist(t(cbind(i,dat)))[1:ncol(dat)]
})
d2=cor(dat,centroids,method="pearson",use="pairwise.complete.obs")
d3=cor(dat,centroids,method="spearman",use="pairwise.complete.obs")
p1=apply(d1,1, function(x){
  colnames(d1)[which.min(x)]
}) 
p2=apply(d2,1, function(x){
  colnames(d2)[which.max(x)]
}) 
p3=apply(d3,1, function(x){
  colnames(d3)[which.max(x)]
}) 
table(p1,p2)
table(p3,p1)
table(p3,p2)
save(prediction,distances,centroids,dat,file = 'output_for_pam50.Rdata')

step4：检查分离器效果

rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(ctc)
load(file = 'input_for_pam50.Rdata')  
load(file = 'output_for_pam50.Rdata') 
table(p1)
phe=as.data.frame(cbind(phe,p1,p2,p3))
colnames(phe)=c('sample','type','dist','pearson','spearman')
phe=phe[phe$type!='',]
table(phe$type,phe$dist)
table(phe$type,phe$pearson)
table(phe$type,phe$spearman)

step5: 把PAM50应用到你自己的数据

rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(ctc)
load(file = 'input_for_pam50.Rdata')  
if(F){
  # 这里面的数据集文件有点大， 所以我注释掉这一块代码
  # [AgilentG4502A_07_3]
  # (n=597) TCGA hub
  # 下载 AgilentG4502A_07_3 后自己格式化成为breat_array_tcga.Rdata
  load('breat_array_tcga.Rdata')
  cg=rownames(pamout.centroids)
  cg
  cg=cg[cg %in% rownames(breat_array_tcga)]
  cg
  dat=breat_array_tcga[cg,]
  centroids=pamout.centroids[cg,]
  save(centroids,dat,file = 'input_for_pam50_tcga_array.Rdata')
}
load(file = 'input_for_pam50_tcga_array.Rdata')
d1=apply(centroids,2,function(i){
  # dist 函数返回倒三角矩阵
  dist(t(cbind(i,dat)))[1:ncol(dat)]
})
p1=apply(d1,1, function(x){
  colnames(d1)[which.min(x)]
})    
table(p1)

pid=gsub('[.]','-',substring(colnames(dat),1,12))
nt=substring(colnames(dat),14,15)
aphe=data.frame(pid,nt,p1)
aphe=aphe[aphe$nt=='01',]
load('subtype_anno.Rdata')
lastPhe=merge(aphe,IHC_clin,by.x='pid',by.y='id') 
table(lastPhe$p1,lastPhe$IHC_sub)

colnames(pam50_clin)
lastPhe=merge(aphe,pam50_clin,by.x='pid',by.y="TCGA.Participant.Barcode")
table(lastPhe$p1,lastPhe$TCGA.Subtype) 

可以看到TNBC和basel的重合度非常高，然后LumA和Normal其实是很难区分开来的。

TNBC和basel的重合度非常高

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